Provupparbetning -preparation

PROVUPPARBETNING

Inledningsvis : arbetet med kemiska substanser kan inom faramkologin delas in i 3 grundläggande s steg; preparation, separation och detektion.

Beskriv arbetsgången för en klassisk farmakologisk analys (t.ex. av ett blodprov)

1. provtagning

2. provupparbetning

3. bestämning

4. beräkning

5. Tolkning = 1. utvärdering 2. validering

6. Rapportering.

Jag ska nu gå igenom det första steget; provupparbetning eller preparation.

Vad är provupparbetning och varför utför man det?

Man förbereder prov för separation och detektion.ALLTSÅ : MAN GÖR PROVET TILLRÄCKLIGT RENT FÖR KOMMANDE ANALYS.

Man gör det för att kunna mäta halt och se vad provet innehåller (kvalitativ och kvantitativ analys).

Målet är alltså att göra någon form av grovfraktionering av provet.

Vilka typer av metoder brukar användas för preparation?

Vätske-vätskeextraktion

Fastfasextraktion

Utfällning

Vad är ”matris”?

Allt annat i provet utom själva läkemedlet /substansen.

Vilken typ av frågeställningar tar man ställning till innan preparatuionen?

Vilken typ av prov handlar det om?

Vad innehåller provet?

Löslighet för analyten?

Stabilitet för analyten? - analyten får inte brytas ner under preparationen, naturligtivis!!!

Koncentration av analyten?

Vilken analysteknik lämpar sig bäst?

Beskriv blod som biologiskt prov!

Blod = plasma och serum

Koncentrationen kan korreleras till farmakologisk effekt – OBS!

Blodprov ger en aktuell bild – dvs. man kan ge LM och sen mäta vid olika tidpunkter.

Inte så mycket metaboliter!!!

Kroppsegna ämnen (proteiner, celler osv) – reagerar med LM, studera hur!

Beskriv urin som biologiskt prov! Vad är skillnaden mot blodprov?

Ingen direkt korrelation till farmakologisk effekt – istälelt kan man se vad som hänt med LM i kroppen.

Urin ger alltså en mer historisk bild.

Höga halter av metaboliter och kroppsegna ämnen.

Vilka praktiska hänsyn måste man ta vid provtagning?

Material i provtagningsutrustning – får ej avge /ta upp molekyler/atomer till/från analyten!

Förvaring – temperatur, ljus, etc.

Avlägsna blodkroppar.

Vad innebär IS – intern standard vid provtagning?

Att en substans som liknar analyten i hög utsträckning tillsätts då en standardkurva konstrueras. En standardkurva innebär att x antal kända koncentrationer (t.ex. 5 stycken) bildar en rät linje i ett diagram. Standardkurvan används för att kunna läsa ut okänd koncentrationen i ett prov, genom att relatera den till den räta linjens ekvation i standardkurvan. Vid IS så tillsätter man alltså två substanser med samma koncentrationer hela tiden. Kvoten mellan deras signaler räknas ut, och utifrån denna kvot konstruerar man själva standardkurvan.

Varför tillsätts IS? Och när?

Den ska tillsättas FÖRE provupparbetningen!

Den tillsätts för att kompensera för variationer och felkällor som missar i signaleringen, volymförluster, fel i pipetteringen osv. Det ger alltså ett mer precist resultat!

Vilka tekniker används vid provupparbetning av biologiska prov för att bli av med albumin, cellrester osv?

Utfällning!- kan förstås endast användas då LM inte är ett protein.

Vätske-vätske-extraktion!

Fastfasextraktion!

Hur utförs proteinutfällning? (alltså att proteiner fälls ut ur lösningen i fast form)

Starka syror kan tillsättas.

Organiska lösningsmedel.

Salter.

Vilka fördelar finns med proteinutfällning?

Snabbt och enkelt

vilka nackdelar finns?

Ingen upprening

Ingen koncentrering av

risk för medfällning av analyt

ej kompatibelt med gaskromatografi.

Vad innebär vätske-vätskeextraktion (LLE)?

Det innebär att två vätskor används, oftast en i organfas och en med polär fas. Låt säga att analyten är polär – då stannar den i polära (vattenfasen) fasen. Opolära ämnen följer istället med opolära, organiska fasen.

Vad används vätske-vätskeextraktion till?

Isolering av ett ämne.

Separation.

Uppkoncentrering.

Uppreningssteg före detektion och kvantitativ bestämning av ämnen.

Bedömning av läkemedels absorbtion i tarmen.

Hur regleras LLE?

pH i vattenfasen!

Solvatiserande egenskaper hos organfasen

Fasvolymsförhållandet.

Hur beräknas extraktion av svaga syror?

Bara en oladdad form av syran kan tas upp i organsfas. Och när är en syramolekyl oladdad? Jo, i pH som är lägre (minst två steg) än syrans pKa. Då kan ju inte syran avge sina protoner till omgivningen.

Fördelningskonstanten : (KD) är inte bara ett skitparti (haha) utan också en konstant.

[HA]org = oladdad form av syran

[HA]aq = laddad form av syran

K_D(HA) = [HA]org/[HA]aq Låt säga att Kd = log 4. Log 4 = 10 000. eftersom det är en kvot vi talar om så är förhållandet så att det går 10000 [HA]org på 1 [HA]aq. Alltså befinner sig då merparten av Hamolekylerna i opolär form och organisk fas!

K_D är konstant vid konstant temperatur i samma fastfassystem.

Fördelningen av ett ämne (HA) mellan två icke blandbara faser kan beskrivas med fördelningsförhållandet : D_HA

D_HA = C (HA_org)/C(HA_aq) = [HA]org/ ([HA]aq + [A-]aq) dividering på alla sidor med [HA]aq ger :

DHA = KD(HA)/ (1 + KHA/aH+)

Samma sak gäller för svaga baser. Då blir fördelningsförhållandet :

DHB+ = KD(B)/ (1 + aH+/ KHB+)

(aH+ = H3O+ i detta fall)

Man kan använda LLE för att separera två ämen i en lösning ifrån varandra (separation) – vilka kriterier måste då råda?

Skillnaden i fördelningsförhållande (D) mellan ämnena måste skilja minst 4 log-enheter. Det vill säga om log D för ämne 1 = 4 så måste log D för ämne 2 vara = 0 eller under.

Extraktionsbetingelserna (pH, KD osv) måste vara sådana att Porg måste vara över 99%. övriga ämnen ska vara försumbara, dvs. Porg under 1% för deras del. Vid lika volym för organ respektive vattenfas ska log D vara över 2 för den ena och under -2 för den andra, alltså.

Vilket lösningsmedel ska man välja vid LLE?

Har du en vätedonerande analyt – väl ett väteaccepterande lösningsmedel.

Har du en väteaccepterande analyt – välj ett vätedonerande lösningsmedel.

Ge några exempel på protonaccepterande grupper!

Alkohol

aldehyd

amid

karboxylsyror

ge exempel på protondonerande grupper!

Alkhol

karboxylsyror

fenol

vatten

Återigen : vad avgör/påverkar fördelningsförhållandet för protolyter?

Lösningsmedlets Kd och pH.

Beskriv arbetsgång för LLE!

1. ställ in provets pH

2. Tillsätt organisk fas

3. Skaka

4. centrifugera

5. Isolera den organiska fasen.

6. Eventuellt : indunsta organiska fasen eller lös upp i bra lösningsmedel.

7. Injicera i analysapparatur.

Fördelar med LLE?

Enkelt

Möjlighet att reglera utbyte och selektivitet.

Nackdelar med LLE?

Svårt att automatisera.

Tar lång tid.

Lösningsmedel förbrukas – de är ofta skadliga för miljön!

Vad innebär fastfasextraktion?

Som bilden visar : ett system bestående av en fast fas (tänk : filter) och en mobil fas = lösningsmedel med analyt i. Man ser med hjälp av pH och fastfas till att analyten trivs bättre i fast fas än i mobil fas. På så vis kommer analyten att fastna i filtret och andra ämnen som skiljer sig kemiskt från analyten kommer att rinna ut med lösningsmedlet. Till slut används ett annat lösningsmedle som tar med sig analyten ut ur kolonnen så att man kan samla upp den; nu i renad form. Fastfasextraktion kan utföras manuellt eller automatiskt.

Vilka olika typer av fastfaskolonner finns?

Stationärfas av olika typ är :

C18 – opolär = drar till sig opolärtill moderat polär analyt

C8 – samma som C18

SAX - (+)laddad stationärfas = drar till sig negativt laddad analyt (anjon-analyt)

SCX - (-)laddad stationärfas = drar till sig positivt laddad analyt.(katjon-analyt)

Diol – Normal phase extraction av polära substanser.

Fenyl – Reversed phase extraktion av opolära till moderat polära substanser framförallt aromater!

vilka krafter interagerar mellan stationärfas och analyt i :

1. C18

2. C8

3. Fenyl

4. diol

5. SAX

6. SCX

1. Van der Waals

2. Van der Waals

3. Van der Waals

4. Vätebindningar

5. elektrostatiska

Vad innebär ”reversed phase” kromatografi?

Att stationärfasen är opolär, dvs C18kolonn eller motsvarande.

Fördelar med fastfasextraktion?

• lätt att automatisera.

• Många typer av stationärfaser att tillgå

• Låg förbrukning av lösningsmedel

Nackdelar med fastfasextraktion?

• svårare än i LLE att förutsäga utbyte

• stationärfasens kapacitiet är begränsad. Man kan inte använda stora volymer, alltså.

Sammanfattningsvis :

varför behövs provupparbetning?

Som förberedelse för kvalitativ och kvantitativ analys.

Olika provupparbetningsmetoder?

1. utfällning

2. vätske-vätskeextraktion

3. fastfasextraktion